角膜营养不良

研究者对病因仍有争议，倾向于认为与年龄和遗传有关，某些病例表现为常染色体显性（autosomal dominant，AD）遗传，或与 X 染色体有关²。

1、影响角膜内皮细胞生物学的分子机制

Fuchs 角膜内皮营养不良（Fuchs endothelial corneal dystrophy，FECD）的确切发病机制尚不清楚，但证据表明存在多种细胞变化，包括细胞外角膜基质变化、表观遗传修饰、角膜内皮-间充质转化（Endothelial-Mesenchymal Transition，EnT）、细胞凋亡、细胞应激和未折叠蛋白反应。

（1）细胞外角膜基质变化

FECD 组织的基因阵列分析和免疫组织化学显示角膜基质组成异常和不同角膜基质蛋白的上调，包括胶原蛋白 I、III、XVI、纤维连接蛋白、聚集蛋白、转化生长因子β诱导蛋白（transforming growth factor beta-induced protein，TGFBIP）和整合素α4³。细胞外角膜基质成分的失调和异常沉积是一种纤维化样过程，是早期和迟发性 FECD 的常见结果。

（2）表观遗传修饰（DNA 甲基化和 miRNAs）

最近的研究表明，表观遗传修饰可能影响迟发性 FECD 的表现，并可能为治疗提供一种选择。表观遗传修饰是基因表达的可遗传变化，不会改变 DNA 序列本身。表观遗传修饰可以解释在相同基因型中观察到的表型差异。

（3）EnT

EnT 过程中，细胞-细胞和细胞-角膜基质相互作用异常，导致角膜内皮细胞活化，细胞极性丧失，并从基底膜上分离，获得包括胶原蛋白 I 和纤维连接蛋白合成增加的间充质细胞特性⁴。这些转化的角膜内皮细胞表现类似角膜基质成纤维细胞，能够大量沉积角膜基质。

（4）氧化应激、线粒体自噬和细胞凋亡在内的不同机制可能解释 FECD 中观察到的高角膜内皮细胞丢失率。

1）氧化应激会诱导线粒体功能障碍、线粒体自噬和细胞死亡。由于角膜内皮泵功能期间，作为 ATP 生成的高代谢过程的一部分，线粒体活动和活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的生成较高，线粒体 DNA 极易受到氧化损伤。与对照组相比，FECD 细胞中线粒体 DNA（mtDNA）和核 DNA 损伤的积累更大⁵。氧化应激可能导致 FECD 细胞对p53 调节的凋亡更敏感⁶。FECD 的未来治疗可能直接针对减轻 ROS 形成和防止线粒体损伤。伊拉米肽是一种增加线粒体呼吸、电子转运和 ATP 生成的肽，已被研究用于治疗线粒体功能障碍的其他疾病，可能用于 FECD⁷。

2）FECD 中角膜内皮细胞凋亡率较高已得到充分证实⁸。在 FECD 的角膜上皮细胞和角膜细胞中也观察到细胞凋亡增加⁹。在 FECD 中，在角膜各层均发现外在和内在的凋亡标记物增加，如 Fas、FasL、Bcl-2 和 Bax⁹。

（5）内质网应激和未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR）

还有观点认为 UPR 可能促进 FECD 中的角膜内皮细胞丢失。内质网负责蛋白质的折叠和合成。未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔中的积累可导致内质网应激。UPR 负责清除错误折叠的蛋白质，但延长的内质网应激可能触发细胞凋亡。在迟发性 FECD 中，内质网表现出扩大状态，细胞表达 UPR 应激标志物（GRP78、phospho-eIF2α、CHOP）和细胞凋亡标志物（半胱天冬酶 3 和 9）增加¹⁰。

2、FECD 相关的基因

有观点认为 FECD 具有散发性或常染色体显性遗传特征。IC3D 分类将 FECD 描述为更常见的散发性遗传⁴⁰，而不完全外显性和迟发性表现使得一些病例难以分类为自然产生或常染色体显性遗传^40-42。表 1 和表 2 中描述了与 FECD 最普遍相关的基因变化。

（1）胶原蛋白 VIII 型α2 链（Collagen type VIII alpha 2，COL8A2）

胶原蛋白 VIII 是一种短链胶原蛋白，是 DM 的主要成分^43-44。该蛋白含有α1（VIII）和α2（VIII）链的同源和异源三聚体^45-46。COL8A2 突变可能导致角膜生物力学强度改变。敲入纯合子 Q455K 和 L450W 基因的小鼠表现出在角膜内皮细胞丢失之前形成较软的 DM⁴⁷。蛋白质胶原蛋白结构的改变可能会妨碍紧密前部带状层的正常形成，从而使 DM 更软，与 FECD 患者中观察到的情况相似⁴⁸。到目前为止，早发性 FECD 仅与 COL8A2 相关，证据强烈支持以多种方式变化的胶原蛋白链会影响其在早发性 FECD 中的结构和功能。

（2）转录因子 4（Transcription factor 4，TCF4）

TCF4 编码 E 2–2 蛋白，它是 I 类碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子的一部分¹⁵。TCF4 变异被认为是欧洲血统高加索人迟发性 FECD 最常见的原因，存在两个变异拷贝使 FECD 的发病几率增加了 30 倍^14,49。TCF4 TNR 扩增和 SNP 在患有 FECD 的非洲裔美国人和亚洲人群中均有出现，但患病率较低^19,49。

（3）其他突变还有ZEB1/转录因子 8（TCF8）、SLC4A11、LOXHD1、ATP/GTP 结合蛋白 1（ATP/GTP-binding-like 1，AGBL1）、TGFBIP、簇集素（Clusterin，CLU）、FECD 基因位点。对迟发性 FECD 家系进行基因分型，发现 4 个基因位点：FCD1（13 号染色体，短臂，13 pTel-13q12.13）⁵⁰、FCD2（18 号染色体，长臂，18q21.2-q 21.32）⁵¹、FCD3（5 号染色体，长臂，5q33.1-q35.2）⁵²和 FCD4（9 号染色体，短臂，9p22.1-p24.1）¹⁸。已经确定了 1、7、15、17 号染色体和 X 染色体中的其他基因位点⁵³。

已确定与后部多形性角膜营养不良（posterior polymorphous corneal dystrophy，PPCD/PPMD） 相关的多个基因位点（表 1），已知其中大多数参与角膜内皮细胞向角膜上皮表型的转变。

1、PPCD 1 位点-Ovo 样锌指2（Ovo like zinc finger 2，OVOL2）

在 PPCD 中发现了 OVOL2 启动子序列的 4 种突变³⁸。OVOL2 是一种参与间充质-角膜上皮转化的 C2H2 锌指转录因子，是 ZEB1 的直接转录抑制因子，同时也与 PPCD 有关³⁸。OVOL2 在 PPCD 中的作用需要进一步研究，但这些突变可能引起 OVOL2 过表达，从而导致 ZEB1 被抑制和角膜内皮细胞角膜上皮样特征表达引起角膜内皮失代偿^37-38,64。

2、PPCD2 位点-COL8A2

对来自同一家族的两名 PPCD 患者的研究发现 COL8A2 中存在 Q455K 错义突变¹¹。这种突变可能是 PPCD 的一种罕见多态性，因为随后对其他 PPCD 家族的研究未能发现相同的突变^65-67。

3、PPCD3 位点-ZEB1

ZEB1 的多种突变与 PPCD 相关¹⁷。ZEB1 在 EMT 中发挥作用，并与 PPCD 位点 OVOL2 和 GRHL2 具有相互反馈回路，两者均支持间充质-角膜上皮转化^64,68。因此，三个基因位点之间平衡的改变可能会改变角膜内皮细胞特征⁶⁴。如前所述，FECD 中也存在 ZEB1 突变。更多与 PPCD 相关的 ZEB1 突变为无义突变，而引起 FECD 的突变为错义突变¹⁸。因此，由于单倍剂量不足（haploinsufficiency）与蛋白质功能障碍的差异，PPMD 和 FECD 的疾病发作和严重程度可能不同¹⁸。

4、PPCD4 位点-粒状头样转录因子（Grainyhead like transcription factor，GRHL2）

GRHL2 基因内含子区域内的突变也与 PPCD 相关³⁹。与 OVOL2 一样，GRHL2 在间充质-角膜上皮转化中发挥作用，是 ZEB1 的直接转录抑制因子³⁹。

1、与涉及多个基因的 FECD 和 PPMD 不同，先天性遗传性角膜内皮营养不良（congenital hereditary endothelial dystrophy，CHED）主要与 SLC4A11 突变相关^22-23,30。

2、虽然与 FECD 相关的 SLC4A11 突变通常导致显性传递，但由于两个等位基因的蛋白功能丧失，CHED 中的突变似乎是隐性的^13,23,30。大多数 CHED 相关突变导致蛋白质折叠缺陷和细胞表面蛋白质转运不良，而 FECD 相关突变不会损害转运，因此 CHED 相关突变可能导致更多功能障碍²⁰。CHED 中的突变与角膜内皮发育和角膜内皮细胞过早死亡期间神经嵴细胞功能失调有关^23,30。更准确地说，SLC4A11 已定位于线粒体内膜，并抑制 ROS 化物质的形成⁶⁹。

1、角膜内皮和角膜上皮的屏障功能以及角膜基质的独特结构共同维持角膜透明。

（1）角膜单层内皮细胞由紧密交错的六角形细胞和不连续的顶端紧密连接组成^70-71。人出生时角膜内皮细胞密度约为 5000 个/mm²，随着年龄增长逐渐下降，成年后平均降至 2400 个/mm^270-72。

（2）角膜单层内皮细胞和附着的 Descemet 膜（Descemet’s membrane，DM）复合体结构独特，在角膜功能中发挥重要作用。DM 是角膜单层内皮细胞的基底膜，由前部带状层（在子宫内形成）和后部非带状层组成。人出生时 DM 厚度约为 3μm，该厚度随着角膜内皮侧沉积的无定形物质增多而缓慢增加。后层会在整个生命过程中持续增厚⁷³。成年时，膜的厚度达到 10-12μm。

2、角膜内皮细胞来源于神经嵴，其位于特殊的细胞外角膜基质上，角膜内皮的主要功能是将角膜基质保持在窄幅水合作用范围内以提供清晰视力。

（1）由于亲水性的蛋白聚糖和渗漏作用的角膜内皮屏障而产生的渗透压帮助含有营养物质的房水被动扩散到角膜基质中⁷⁴。角膜内皮细胞内的离子转运蛋白主动抵消这种扩散梯度，并将底物从角膜基质转运到房水。

（2）Na⁺/K⁺ ATP 酶泵与基底侧碳酸氢钠协同转运蛋白 NBCe1 共同驱动 Na⁺:2HCO₃^-的协同转运，并促进 Na+/H+交换（NHE）^74-76。NBCe1、NHE、HCO^-和碳酸酐酶形成了一种 pH 缓冲液，通过该缓冲液，乳酸渗透梯度可以驱动水流出⁷⁵。额外的离子交换由 Na⁺/K⁺/2Cl^-协同转运蛋白（NKCC1）、Cl^-/HCO₃^-交换蛋白、SLC4A11 和单羧酸转运蛋白 1、2 和 4 介导^77-78。

（3）角膜内皮细胞损伤将导致角膜内皮细胞层通透性增加，从而损害角膜内皮细胞泵活性⁷⁷。无法保持消肿能力会导致角膜基质变厚、肿胀和云翳，从而导致视力丧失。

3、在人类和其他物种中，角膜内皮细胞停滞在细胞周期的 G1 期⁷⁹。这种复制能力的缺乏在临床环境中产生了巨大影响。当疾病或损伤导致的角膜内皮损失严重到足以影响视觉功能时，需要进行角膜内皮置换手术以恢复角膜的清晰度。

1、前部营养不良

（1）前基底膜营养不良

纤维蛋白沉积导致上皮基底膜增厚，出现高反射点，在生物显微镜下角膜混浊外观明显²。近期，借助共聚焦显微镜和光学相干断层扫描（optical coherence tomography ，OCT），发现细胞外沉积物具有指纹状、点状和地图状外观^80-83。还有其他亚型微囊性营养不良或带状病变，在正常上皮和大量小液泡导致胞质膨大的区域之间观察到移行区^84-86。

（2）胶滴状角膜营养不良

在组织学上，其特征性表现为淀粉样物质在角膜上皮下区域的沉积伴角膜上皮层变薄、Bowman 膜部分破坏，呈现出黄白色胶状外观^87-89。

（3）Meesmann 角膜上皮营养不良

生物显微镜检查显示角膜上皮内微囊，大小均一、呈圆形或椭圆形、密度不一，中间密度最大，但从未延伸至边缘。上皮细胞不规则增厚，有许多细胞质液泡，如囊肿¹。囊肿含有细胞碎屑和成分未知的胞内物质^82-83,87-90。

2、角膜基质营养不良

（1）Reis-Buckler 角膜营养不良

组织学表现为Bowman 膜和上皮细胞之间出现梯形沉积物。

（2）Avellino 角膜营养不良

组织学表现为位于浅层的透明颗粒状沉积物，以及位于深层的格子状淀粉样蛋白沉积物²。据推测，Avellino 角膜营养不良的病理机制与自噬有关，这也是对该机制仍知之甚少的原因所在。

（3）Francois 中央云雾状角膜营养不良

组织学表现为为细胞外液泡与纤维化物质²。因粘多糖和脂质蓄积而产生混浊。

（4）Schnyder 结晶状角膜营养不良

其特征性外观为基质中出现脂质和/或胆固醇结晶状沉积物。角膜基质中脂质和胆固醇沉积。组织学表现为在共聚焦显微镜下观察到浅层角膜上皮细胞在正常范围，而基底细胞层观察模糊，并出现结晶状沉积物延伸到前部基质处^1,91。

（5）Cogan 微囊性角膜营养不良

生物显微镜检查：双眼角膜基质内存在弥漫性“雪花”样白色混浊。组织学表现为共聚焦显微镜下上皮细胞正常，但基质的反射率增加。基质的层状结构被打断，角膜前基质和角膜后基质中心处更多。

（6）Fleck 角膜营养不良

生物显微镜检查：位于角膜深部基质层的双眼黄白色、圆形或椭圆形的扁平细小混浊，不伴有全身异常。组织学表现为一些角膜细胞的胞质内液泡中有纤维腺体组织，另一些含有脂质和粘多糖²。

（7）Groenouw I 型角膜营养不良

生物显微镜检查：不规则的，玻璃样或“碎片状”角膜基质混浊^2,91。组织学表现为角膜基质细胞和上皮细胞中存在磷脂和微纤维沉积物，浸润灶主要累及角膜基质。

（8）格子状角膜营养不良

LDC I 型影响基质和上皮水平。LDC II 型影响 Bowman 膜下淀粉样蛋白沉积物水平，有时也会影响上皮基底膜。LDC III 型影响淀粉样蛋白沉积物水平。内皮和 Descemet 膜不受影响。

（9）斑块状角膜营养不良

生物显微镜检查：角膜中心部位灰白色混浊，随年龄增长，病变延伸至周边并累及整个角膜基质，并导致角膜变薄。MCD 分为 2 种亚型：根据有无血清硫酸角质素可分为 I 型和 II 型²。组织学表现为基质和 Descemet 膜细胞外沉积物蓄积，以及角膜细胞和内皮细胞中胞内储存物质蓄积。

（10）PDCD 或丝状角膜营养不良

生物显微镜检查：后部角膜基质细小混浊灶，伴脂质沉积物。组织学：病理改变仅限于角膜后基质中的角化细胞，导致脂质物质蓄积，更类似于一种在衰老细胞中蓄积的退行性色素，即脂褐素^2,91。

3、后部角膜营养不良

（1）先天性遗传性角膜内皮营养不良

组织学表现为Descemet 膜增厚、内皮萎缩、淀粉样蛋白沉积和球状变性。与 FECD 和 PPMD 相似，CHED 表现出 DM 增厚、分层和角膜内皮细胞变性⁴⁰。

（2）Fuchs 角膜内皮营养不良

组织学表现为成纤维细胞样内皮细胞，胞质丝数量增加，吞噬色素颗粒，半桥粒数量增加²。在角膜内皮显微镜下，角膜内皮细胞表现出细胞增大（多聚性）和不规则性增加（多态性）；滴状角膜表现为暗影（图 1 B）⁵⁵。由于细胞外角膜基质物质沉积增加，DM 也受到影响并且显得异常厚。当细胞充当功能性巨噬细胞时，也可能出现角膜内皮色素沉着。慢性和晚期不受控肿胀可能导致疼痛性大泡和角膜上皮下纤维化，并可能会影响角膜内皮移植后的长期视力结果^92-93（图 1 A）。

（3）后部多形性角膜营养不良

组织学表现为水泡、带状病变和弥漫性混浊。特征为角膜上皮样角膜内皮细胞和 DM 后部非带状部分增厚、分层（图 2 A）⁴⁰。