耐药结核病

1、分枝杆菌细胞壁上有选择性吸附阳离子的孔蛋白，能有效控制或阻滞亲水性小分子的扩散，大大降低了化合物的渗透性，导致药物进入高疏水性细胞壁间隙比较慢，这便筑成了 MTB 对药物的第一道防线；且 MTB 有相对的耐干燥、耐碱等特性，使得它很难被清除。

2、MTB 的细胞壁和其他细菌有着很大的差别，其中类脂质含量超过60%，而革兰阴性细菌类脂质含量仅占20% 左右，类脂质是一类复杂的复合物，其赋予 MTB 表面疏水性，含有：

(1) 分枝菌酸（是 MTB 和棒状杆菌属独有的结构，主要由 22 ~24 碳短链和 40-64 长链分枝脂肪酸组成，使 MTB 免受溶菌酶、自由基等损伤，抵抗亲水性化合物或抗生素的攻击；

(2) 索状因子（是分枝菌酸和海藻糖结合的一种糖脂，能使细菌在液体培养基中呈蜿蜒索状排列），此因子与分枝杆菌毒力密切相关， 它能破坏细胞线粒体膜，影响细胞呼吸，抑制白细胞迁移和引起慢性肉芽肿，若将其从细菌中提出，则细菌丧失毒力；

(3) 磷脂（ 能促使单核细胞增生，并使炎症灶中的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核结节）；

(4) 蜡质D（一种肽糖脂和分枝菌酸的复合物，可从有毒株或卡介苗中用甲醇提出，具有佐剂作用，可激发机体产生迟发型超敏反应）；

(5) 多糖类及细胞壁黏肽等，因基因突变而导致 MTB 细胞壁结构发生改变，从而使 MTB 具有耐药性，突变基因有katG、inhA、ahpC、oxyR、kasA、ndh、embC、embA、embB、alrA、gadA。

MTB 耐药性的产生多由其基因组上编码药物标靶的基因或与药物活性有关的酶的基因突变所造成，即基因型耐药。基因型耐药的基础是在大量 MTB 群中存在天然抗药突变株，这些突变株在药物的选择压力下保留并繁殖，基因型耐药的菌株能够将耐药特性传递给后代菌株，后代菌株能保持并遗传其耐药性，编码药物标靶的基因或与药物活性有关酶的基因发生突变而产生耐药性的主要机制及相关药物如下。

1、以抑制 MTB 蛋白质的合成为主；如链霉素、卷曲霉素、阿米卡星、卡那霉素、大环内酯类药物及对氨基水杨酸钠等药物。

2、以抑制 MTB 的 RNA 合成为主；如利福平。

3、以抑制 MTB 的 DNA 转录酶为主；如氟喹诺酮类药物。

4、以耗尽 MTB 细胞膜能量为主；如吡嗪酰胺。

在 MTB 中已经发现了活跃的药物外排泵系统，外排泵能将菌体内药物泵出，使得胞内药物浓度不能有效抑制或杀灭分枝杆菌， 从而产生耐药性。

1、研究表明，分枝杆菌存在药物主动外排泵的表达，并被视为是 MTB 药物靶分子突变机制外的一个重要机制，外排泵是膜上参与代谢的一些蛋白，它们认为抗生素是外来毒素而将其排出膜外。最早人们只是在肿瘤细胞及细菌中发现存在外排现象，

并导致低浓度耐药的产生，虽然导致的是低浓度的耐药，但正是外排泵的出现增加了基因突变的频率，并最终导致高浓度耐药的产生。

2、研究发现，分枝杆菌外排泵能将其细胞内的药物泵出，使得胞内药物浓度不能有效抑制分枝杆菌的生长，从而产生对抗生素的耐受性。药物外排系统根据其蛋白氨基酸同源性可分成很多种类，MTB 的 H37Rv 株基因组有 20 个编码假想外排泵的开放阅读框（ORF）。

3、目前，仅有几种分枝杆菌外排泵得到了一定研究，分别为属于主要易化超家族（MFS）的 LfrA、Rvl634、EfpA、Tet（V）、P55、Tap、Rv1258c；属于耐受小节分裂区家族（RND）的 MmpL；属于 ATP 结合超家族（ABC）的 DrrAB、Pst、Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c；属于小耐多药家族（SMR）的 Mmr 等。其中 LfrA 为分枝杆菌中被发现的第一个功能外排泵，具有较广的底物专一性。

1、异烟肼（INH）

INH 的作用机制是被 MTB 内的触酶-过氧化物酶 katG 活化，抑制了烯酰基载体蛋白还原酶 inhA，从而抑制分枝菌酸和细胞壁的生物合成，丧失多种能力如抗酸染色、增殖性和疏水性，最终导致死亡。对异烟肼耐药的 MTB 与多种基因突变有关，目前与 INH 耐药相关的突变基因有 katG、inhA、sigl、ahpC-oxyR、kasA、ndh、nat 和 mshA 等，其中 katG 和 inhA 基因是主要耐药基因，二者占总耐药基因引起耐药的90%以上。

(1) katG 基因

分析发现导致异烟肼耐药性的原因主要包括 katG 基因的插入、缺失以及点突变。463 位 CGG→CTG、315 位 AGC→ACC 是最常见的 katG 基因点突变，除此之外 katG 基因突变点还包括 104、108、138 及 148 位。katG 基因突变破坏触酶-过氧化物酶的产生，从而使 IHN 对 MTB 无法产生作用。

(2) inhA 基因

inhA 基因是烯酰基载体蛋白还原酶的编码基因，如果 inhA 基因出现结构突变，则会降低烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和异烟肼的亲和力，进而出现耐药。inhA 结构基因常见的突变位于16、21、47 和 178 位密码子上；inhA 基因启动子突变常见于碱基对的置换，如24 位（G→T），16 位（A→G）或 8 位（T→G）；除此之外 inhA 基因的调节序列发生突变或者 inhA 基因中的某一点发生突变，则会导致 inhA 基因蛋白过度表达，从而导致异烟肼耐药。inhA 基因的过度表达造成分枝菌酸的过度合成，而 katG 基因突变主要是由 ahpC 基因突变造成的。

(3) kasA 基因

kasA 基因突变在对异烟肼耐药中所起的作用还不清楚，有部分学者在敏感菌株中也发现有 kasA 基因突变。

2、利福平（RFP）

(1) RFP 的作用机制是与 MTB DNA 依赖的 RNA 聚合酶 β 亚单位（rpoB）结合，从而抑制其活性，进而对 mRNA 转录进行抑制，干扰 DNA 及蛋白质的合成，导致细胞死亡。

(2) rpoB 基因则是 RNA 聚合酶 β 亚基所依赖的编码基因，在位于 RNA 聚合酶 β 亚单位 rpoB 核心保守区域出现突变时，如缺失突变、插入突变或者点突变等，约 97% 对 RFP 耐药的 MTB 受 RNA 聚合酶 β 亚单位的 rpoB 基因突变影响，造成 RFP 与 RNA 聚合酶之间的亲和力减小，从而导致 MTB 对 RFP 产生耐药性。

(3) RNA 聚合酶 β 亚单位 rpoB 核心保守区域的突变 96% 主要集中在一段 81bp 的区域内，其中 65%-86% 的突变位于 526 或 531 位密码子，并导致对 RFP 的高度耐药，临床上将检测这个区域的突变作为 MTB 对 RFP 耐药的参考，而511、516、518 和 522 位密码子的突变与 MTB 对 RFP 低水平的耐药相关。

3、链霉素（Sm）

MTB 对 Sm 耐药的相关基因主要包括编码核糖体蛋白 S12的 rpsL 基因和编码 16SrRNA 的 rrs 基因，对 Sm 耐药的 MTB 大部分都与上述 2 个基因突变有关。rplL 突变率高于rrs，rpsL 突变位点主要集中在 43 位和 88 位密码子上，rrs 的突变位点主要集中在 491 位、512 位和 516 为密码子上。

4、乙胺丁醇（EMB）

EMB 是一种阿拉伯糖类似物，作用于分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶，使阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯甘露聚糖合成障碍，MTB 无法

合成完整的细胞壁并造成分枝菌酸积累，导致细菌死亡。阿拉伯糖基转移酶的编码基因为 embABC 操纵子基因，其过量表达导致 MTB 对 EMB 产生耐药性。embABC 操纵子基因是由 embA、embB 和 embC 等 3 个基因构成的复合物，耐 EMB 菌株的常见突变点为 embB 基因的 306 密码子。

5、吡嗪酰胺（PZA）

PZA 需经 pncA 基因编码的 PZA 酶催化才能变为活性形式，约 72%~98% 对 PZA 耐药的菌株存在 pncA 基因突变，使 PZA 酶失去活性从而抑制吡嗪酸的合成，最终导致菌株耐药。pncA 基因位点突变呈高度多样性，但有 3 个密码子区域如 3~17位、132~142 位、61~85 位有相当程度的聚集性。

6、氟喹诺酮类药品

氟喹诺酮类药品的主要作用是抑制 MTB 脱氧核糖核酸 DNA 回旋酶，该酶由 gyrA 和 gyrB 基因编码。gyrA 基因和 gyrB基因突变主要集中在一个保守区域，此区域编码的是氟喹诺酮类药品与 DNA 回旋酶相互作用的位点，研究表明 gyrA 基因上单一的错义突变与 MTB 对氟喹诺酮类药品低水平耐药有关，而高水平耐药一般在 gyrA 基因上发生 2 个或 2 个以上的错义突变，或者gyrA 基因和 gyrB基因同时产生突变。