着色芽生菌病

1、被忽视的热带病（neglected tropical diseases，NTD）包括在世界范围内流行于热带或亚热带地区的一系列地方性热带和亚热带疾病。包括蠕虫、原虫、细菌和病毒感染在内的多种地方病被世界卫生组织（world health organization，WHO）定义为“被忽视的疾病”，但不包括除足菌肿（植入性真菌病）以外的真菌病^1-2。

2、植入性真菌病也被归为“皮下真菌病”，是指通过几种经皮创伤感染的几种真菌病^3-4。植入性真菌病包括全球感染，如植入性暗色丝孢菌病（phaeohyphomycosis，PHM）、虫霉病和地方性真菌病，如孢子丝菌病、真菌性足菌肿、洛博芽生菌病和着色芽生菌病^3-9。

3、着色芽生菌病（chromoblastomycosis，CBM）也称为着色真菌病，是最普遍的植入性真菌感染，在黑色素或棕色真菌引起的真菌病中最常见。CBM 主要是热带或亚热带疾病，可累及世界各地具有某些危险因素的个体。着色芽生菌病是一种被忽视的罕见病。其全球负担与足菌肿相当甚至更严重，与足菌肿一样，主要是一种职业性真菌病。由于其遍及全球，累及贫困人群且难治，应被视为 WHO 定义的真正被忽视的疾病^2,10-12。表 1 中列出了各国对 CBM 的俗称和医学命名。

1、致病真菌分类

(1) 如果将 CBM 定义为导致宿主组织过度增生的植入性真菌病，且砖格状细胞中存在真菌的致病相，则该病的大多数病原体都来自真菌界的同一目，即刺盾炱目（chaetothyriales）。该目中仅有一个科，即小疱毛壳科（herpotrichiellaceae）。CBM 的有限分布范围（毛壳菌属除外）²⁹表明，该宿主-真菌相互作用具有高度特异性，因为 CBM 几乎仅见于功能性免疫健全的患者。由黑色真菌引起的特异性较低的对应疾病 PHM 通常引起组织坏死而非增生，其病原体在整个真菌界的分布明显更广，且主要与免疫功能紊乱相关。

(2) 毛壳菌目特别著名的真菌是外瓶霉属，即所谓的“黑色酵母菌”之一，能够通过出芽繁殖。其亲缘菌种都是严格的丝状真菌，包括所有 CBM 病原体。黑色素始终存在于繁殖细胞和营养细胞中，因此，由于存在二羟基萘（dihy-droxynaphthalene，DHN）-黑色素，毛壳菌目的菌落通常为橄榄状、深灰色或黑色阴影。DHN-黑色素是一种疏水性、带负电荷的高分子量化合物，由酚类和/或吲哚类氧化聚合产生³⁰。

(3) 毛壳菌目的生长通常缓慢。根据其克隆繁殖模式来区分各属。在喙枝孢属（rhinocladiella），分生孢子在细长的细胞延伸上共生产生；而在丰萨卡菌属（fonsecaea），分生孢子聚集在小齿上，呈短链排列；在支孢瓶霉属（cladophialophora），分生孢子排列成长的干链；在瓶霉属（phialophora）和杯梗孢属（cyphellophora）中，分生孢子通过卷须在粘头中产生；而杯梗孢属的不同之处在于，其分生孢子为卷曲状，大多有分隔；在维朗那霉属中，产生分生孢子的细胞呈环节状，而输送的细胞则有密集的出芽。

(4) 在同一菌株中，不同的形态类型可能彼此相邻，上述属缺乏系统发育意义。同属的菌种在形态上往往无法相互区分；为了可靠区分菌种，有必要对诊断基因进行测序³¹。另一方面，尽管分子分类学应用后与 CBM 病因相关的菌种数量增多，但新的菌种基因分型并未影响临床和治疗。

2、生物多样性

(1) 丰萨卡菌属

1) 丰萨卡菌属包含 4 个可导致 CBM 的菌种：裴氏丰萨卡菌（F.pedrosoi）、F.monophora、F.Nubica 和 F.pugnacius。Fonsecaea monophora 和 F.Pugnacius 具有显著嗜神经性，最终导致感染播散至脑和其他器官^32-34或引起原发性脑感染而无皮损，这些是 PHM 的临床表现，因为组织中未见砖格状细胞^35-36。

2) 丰萨卡菌属的所有菌种都有毡样、灰橄榄样菌落。菌丝规则，黑色素化，在顶端形成分枝。终末细胞有 1～4 个小齿，每个小齿带有单细胞、宽棒状分生孢子，进而在小齿上产生 1～2 个较小的分生孢子³¹。尤其是在缺乏营养素的培养基中，可能从大卷须生出带有分生孢子粘头的瓶梗。丰萨卡菌属在 33°C 下发育最佳，其生长能够耐受的最高温度为 37°C。这些基准温度略高于严格环境菌种³⁷。

3) de Hoog 等³⁴和 Najafzadeh 等³⁸之前修订了丰萨卡菌属的分类学。利用 ITS 和 CDC42、B2 和 ACT1 基因的序列，最终补充扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）检测，鉴定出了 F.nubica 和 F.pugnacius 等新菌种^32-33。

(2) 支孢瓶霉菌属

1) 引起 CBM 的两种支孢瓶霉菌，即卡氏支孢瓶霉（C. carrionii）和 C.samoensis，形成灰绿色、干燥、大量产孢的菌落，分生孢子排列成分枝密集的长链，组成灌木样分生孢子系统。此外，这些菌种可能在营养匮乏的培养基上产生瓶霉属样分生孢子。菌种的表型完全相同，靠 ITS 测序可以区分³⁰。

2) 疣状瓶霉（phialophora verrucosa）的瓶梗为单一形态，顶部有大的、深色漏斗状领饰样结构，从中产生椭圆体、单细胞分生孢子的粘头。菌落呈橄榄色-黑色且生长速度适中^22-23,31,39。播散型疾病也有报道，但组织中无明确的砖格状细胞⁴⁰，因此被认为是 PHM。中国的一些类似病例涉及 CARD9 突变者⁴¹。

(3) 播水喙枝孢霉菌属亚洲、非洲和拉丁美洲低收入地区的居民

播水喙枝孢霉（rhinocladiella aquaspersa）形成直立、深棕色、分化良好的分生孢子梗，沿分生孢子梗的末端产生丰富的分生孢子^42-43。分生孢子近透明，为椭圆形至纺锤状，从深色瘢痕中产生。因此该菌种可通过显微镜下形态识别。菌落受限，呈天鹅绒状，橄榄色-黑色。大多数病例来自南美^44-46。

(4) 外瓶霉菌属

1) 外瓶霉是毛壳菌目中唯一产生酵母样相的属。释放的细胞生长和并通过出芽繁殖，或变成近球形，并通过一串或多或少被称为“近球状菌丝体”（高度诊断exophiala）的膨胀细胞逐渐转变为菌丝，近球状菌丝体对外瓶霉有高度诊断意义。菌落呈黑色，生长缓慢，最初呈黏液状，常随时间推移而变干、产生菌丝，形成菌落被污染的印象。

2) 棘状外瓶霉具有长而直立的分生孢子梗和长环形带，而皮炎外瓶霉在同一细胞上有几个非常短、彼此相邻的环形带³¹。其他所有外瓶霉菌种几乎都必须通过测序来鉴别^47-49。

(5) 目前发现的 CBM 相关菌种多样性增加对临床或流行病学的影响有限，因为所有菌种感染的危险因素和治疗方案都基本相同。

1、概述

(1) CBM的特征是：

1) 通过环境来源的创伤性接种植入，在接种部位导致初始皮损；

2) 进行性慢性皮肤和皮下组织结构受累，肉芽肿反应将微脓肿包埋，通常伴有组织增生；

3) 非保护性 2 型辅助性 T 细胞（T helpler type 2，Th2）免疫应答伴无效体液免疫参与；

4) 受累组织中存在砖格状（菌核）细胞。形态学上，砖格状细胞由 2-4 个具有横向和纵向分隔的真菌细胞聚集组成^9,50-53。

(2) 最近的研究表明，CBM 感染中真菌清除能力受损主要是由于病原体的毒力和致病性增强^54-56。几种潜在毒力因子很可能与该疾病有关，包括细胞表面修饰、疏水性、真菌细胞壁重塑、蛋白水解酶和水解酶分泌、黏附分子、芳香烃掺入、载铁体组装，尤其是黑色素。在 CBM 感染中观察到的大多数毒力和致病因子都与其他致病性真菌感染中的相似^55-58。对 CBM 致病性有重要意义的因子是黑色素、砖格状细胞、细胞黏附和疏水性。

2、细胞形态和结构

(1) 多态性：黑化真菌是多态生物。由于其对几种有机和无机环境的可塑性和适应性，黑化真菌的形态具有很强的多样性。引起 PHM 时，在临床标本中病原体可单独或同时出现一系列形态：分隔（串珠状）菌丝、假菌丝、酵母样和囊泡状成分。引起黑色颗粒足菌肿时，黑化真菌通常表现为由短而扭曲的菌丝伴囊泡成分组成的深色或黑色颗粒^3,36,59。菌丝和分生孢子可能在自然界中大量存在，在沙氏琼脂等简单培养基中容易复制^37,60。相反，抵抗态（resistance forms）通常只在极端环境条件下出现，例如极高温或极低温、极端 pH 值和营养缺乏土壤。这些抵抗态在岩石和植物中仍可生存^61-62。

(2) 经皮植入后，CBM 病原体的繁殖体呈现独特的细胞和形态可塑性。

1) 在感染过程中，细胞分化转向分生组织方向，呈现出等径膨胀（isodiametric swelling）和交叉分隔。由此产生的砖格状细胞⁶³也被命名为“欧楂小体（medlar body）”或“铜币”、“彩色石样（chromo）”或“烟菌样小体（fumagoid body）”，以及“菌核或分生组织细胞”⁶⁴。

2) “分生组织”（“meristematic”）一词是植物学术语，指细胞分裂；在黑化真菌中，它主要用于描述栖息在岩石中生长的极端微生物的团块状菌体⁶⁵。

3) “砖格状细胞”（muriform cell）专指呈现分生组织生长的毛壳菌目的细胞，这些细胞是其在活体组织（人类或植物）中的侵袭形态⁶⁶。砖格状细胞可以单独或成群存在。其形状为圆形至多面体形，具有黑色、厚实的细胞壁，以及横向和纵向隔层。砖格状细胞被认为是真菌进化适应从而在宿主微环境内生存的机制⁶⁴。砖格状细胞与剧烈肉芽肿反应和引发慢性疾病的免疫逃避机制直接相关。砖格状细胞仍然是区分 CBM 和含义与之密切相关的 PHM 的重要鉴别诊断依据，PHM 一般不含砖格状细胞⁶⁷。

(3) 微生物黏附和疏水性：是真菌致病机制中最重要的两项因素^68-69。CBM 的感染形态可以黏附于宿主的上皮组织，使其分化为砖格状细胞，从而抵抗宿主的杀伤，并诱发慢性肉芽肿性炎症。胞外亲水性多糖分子的存在可以通过疏水而增强该现象。裴氏丰萨卡菌、皮炎外瓶霉、棘状外瓶霉和卡氏枝孢瓶霉的瓶梗可产生黏附性分生孢子，表明其与节肢动物或其他无脊椎动物载体结合。

(4) 神经酰胺单己糖苷：在致病和非致病性真菌的细胞膜和细胞壁中均已鉴别出神经酰胺单己糖苷（ceramide monohexoside，CMH），与哺乳动物 CMH 相比，其神经酰胺基团与哺乳动物 CMH 不同^69-70。CMH 似乎在宿主免疫应答中具有举足轻重的功能，可能与真菌分化有关。CBM 细胞中脑苷酯的表达与砖格状细胞转变和黑色素沉积密切相关。根据研究结果结果，提出了三种可能性：首先，砖格状细胞中不存在 CMH；其次，CMH 在砖格状细胞上的结构可能不同，会干扰单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）的识别；最后，砖格状细胞上的黑色素结构会损害抗 CMH 抗体与膜靶点的结合⁷⁰。

(5) 蛋白磷酸化和去磷酸化：对于免疫调节非常重要，可影响宿主对入侵真菌病原体的反应^68,71。

3、毒力因子

(1) 耐热性：是毛壳菌目成员最重要的毒力因子之一。致病性丰萨卡菌的最佳生长温度为 33°C，最高生长温度为 37°C⁷²。最佳和最高生长温度的类似差异似乎决定了外瓶霉菌偏好冷血宿主还是温血宿主⁷³。

(2) 坚硬细胞壁：真菌的坚硬细胞壁与分化、生长和适应宿主所需的结构分子的动态流动形成对比。考虑到细胞壁厚度增加和抵抗宿主反应的砖格状细胞形成，菌丝和分生孢子向砖格状细胞的分化可能会增强毒力。

(3) 脂质或无脂质成分：从不同 CBM 病原体中提取的脂质或无脂质细胞壁成分可在小鼠体内诱发明显肉芽肿反应^74-75。事实上，存活的砖格状细胞具有很高的体外诱导朗格汉斯巨细胞形成的能力⁷²。

(4) 几丁质：

由β-1，3-连接葡聚糖和 N-乙酰葡糖胺聚合物形成，具有多种构象，表明其在真菌结构和分化中发挥作用⁷⁶。几丁素合成依赖几丁素合成酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性，三者分别参与胞质分裂、隔膜合成和芽痕形成⁷⁷，每一种都有其催化活性，分别由基因 CHS1、CHS2 和 CHS3 编码⁷⁸，在裴氏丰萨卡菌中有保守序列⁷⁹。裴氏丰萨卡菌的砖格状细胞具有壳六糖单体（chintin）样成分，可通过抑制模式识别受体 1 基因（dectin-1）介导辅助性 T 细胞 17（T helper cell 17，Th17）细胞发育，从而损害免疫应答，促进 CBM 的慢性化²⁹（图 1）。

4、黑色素

黑色素是一种复杂、疏水、带负电荷的大分子，包括吲哚或酚醛聚合物^29,59。在 CBM 病原体中，该聚合物可来源于 L-3，4-二羟苯丙氨酸（左旋多巴）或二羟基萘（dihy-droxynaphthalene，DHN）^29,80。黑色素广泛存在于自然界中，被认为具有免疫活性，在不同致病真菌中是重要的毒力因子^29,81。目前提出了 3 种有关其促进真菌对免疫宿主细胞抵抗力的机制：抵抗白裂解酶的作用；抵抗氧或氮衍生物的作用；减少吞噬作用。在感染期间，裴氏丰萨卡菌产生的黑色素沉积会干扰一氧化氮（NO）产生，抑制吞噬作用⁸²，该效应不能被γ干扰素（interferon γ，IFN-γ）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）逆转。这种吞噬作用抑制也可见于使用完整黑化细胞壁进行的体外培养之后。

5、胞外酶和代谢产物

蛋白水解酶，如肽酶，在病原体-宿主相互作用的连续阶段承担多项任务，能够绕过宿主防御，导致消化或宿主表面破坏。蛋白水解酶可能危害宿主防御机制的不同组分，导致免疫逃壁或抗微生物药物耐药^83-84。Kneipp 等证明，与分生孢子和菌丝体相比，砖格状细胞的磷酸酶活性高，与致病性相关^85-86。表面胞外磷酸酶可水解磷酸化底物。酸性低 pH 化合物可增加酶的活性，而特定化合物如氟化钠和钼酸钠可阻断酶的活性⁸⁶。CBM 病原体产生并分泌一系列水解酶：砖格状细胞壁的磷酸酶、裴氏丰萨卡菌表面发现的胞外 ATP 酶等^87-88。

宿主对 CBM 的免疫机制，包括细胞免疫和体液免疫，都不明确。有些研究已经证明细胞免疫在宿主-真菌相互作用中具有重要意义，表明真菌在原位持续存在是导致 CBM 进展的主要因素。

1、固有免疫应答

(1) 抗原呈递细胞

1) 在固有免疫细胞中，巨噬细胞似乎具有调节真菌生长的重要功能，在皮肤巨噬细胞的胞浆空泡中可检测到 CBM 真菌细胞⁸⁹。Sotto 等研究表明吞噬细胞参与了针对 CBM 病原体的固有免疫⁹⁰，另一方面，活化巨噬细胞似乎在 CBM 中只有抑真菌而无杀真菌作用，可以推迟芽管和菌丝的形成⁹¹，所以裴氏丰萨卡菌能在巨噬细胞内存活并增殖。

2) 巨噬细胞的杀真菌活性取决于 CBM 的病原体，研究结果表明，定居巨噬细胞对播水喙枝孢霉具有杀真菌活性，但对卡氏支孢瓶霉、疣状瓶霉和裴氏丰萨卡菌几乎无活性⁹²。daSilva 等发现，针对 CBM 真菌的吞噬作用具有细胞类型依赖性⁹³。朗格汉斯细胞（langerhans cell，LC）仅对分生孢子有吞噬作用，对裴氏丰萨卡菌的砖格状细胞无吞噬作用。根据这些结果来看，砖格状细胞可通过 Th1 应答导致疾病加重，而分生孢子则将该应答转向辅助性 T 细胞 2（T helper cell 2，Th2）抗体应答（图 1）。

(2) 细胞因子生成

Mazo Fávero Gimenes 等发现，细胞因子表达谱取决于 CBM 的严重程度。临床疾病更严重的患者主要产生白介素（interleukin，IL）-10 并抑制 IFN-γ，只能轻微诱导 T 细胞增殖⁹⁴，而轻度 CBM 患者表现为 IFN-γ 增加和 IL-10 产生减少，能够有效诱导 T 细胞增殖⁹⁵。在轻度 CBM 中，充分的免疫应答有利于 Th1 表达，可抑制疾病进展；而中度 CBM 将诱发介于 Th1 与 Th2 之间的免疫应答。此外，CBM 患者可分泌大量肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNFα）。此外，裴氏丰萨卡菌和播水喙枝孢霉可诱导巨噬细胞分泌 IL-1，而卡氏支孢瓶霉可诱导 IL-6 生成，这表明 IL 生成具有真菌种属特异性⁹⁴。

(3) Toll 样受体的真菌识别作用：由于缺乏 Toll 样受体介导的真菌识别，所以抗裴氏丰萨卡菌细胞因子的生成受损，在体外加入 Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）配体后可恢复，随后在动物模型中可以抵抗体内感染⁹⁶。模式识别受体（patternrecognition recep-tor，PRR）共刺激失败后会发生慢性疾病⁸⁵。外源性补充 TLR 配体可促进体内真菌感染的清除⁹⁶。

(4) PMN 的杀真菌作用：多形核白细胞是典型 CBM 肉芽肿的主要调节细胞⁹⁷。富含 PMN 的脓肿可消除对砖格状真菌的吞噬，其原位存在被认为是炎性反应慢性化的关键因素⁶⁴。（图 1）。

(5) DC 是几种真菌感染中的重要免疫调节细胞。成熟 DC 具有一种特殊能力，能引导幼稚淋巴细胞转向 Th1 应答，而未成熟 DC 则会增强 Th2 应答，诱导免疫耐受。DC 负责监测和皮肤对黑化真菌侵袭的初级防御⁹⁸。（表 2）。

2、适应性免疫应答

与固有免疫相比，细胞介导免疫（cell-mediated immunity，CMI）的抗原特异性和抗原记忆更强，但应答速度更缓慢^68,105。负责吞噬裴氏丰萨卡菌的巨噬细胞可以刺激 CD4+细胞，这对阻止 CBM 发生至关重要¹⁰⁶。在 CBM 患者中，CMI 受损导致对真菌衍生抗原的应答不充分，促使皮损中的致 CBM 真菌得以持续存在¹⁰⁷。裴氏丰萨卡菌 CBM 中出现迟发型超敏反应（delayed-type hypersensitivity，DTH），表明炎症可能由 T 细胞介导⁹⁸。在导致 CBM 皮损的慢性肉芽肿反应中，与 CMI 相关的免疫表型评估主要显示巨噬细胞，但也有 Th 细胞和细胞毒性 T 细胞，以及 B 细胞^108-109。在 CBM 感染中关于体液免疫应答的研究较少，因为此前研究表明这种宿主防御机制不一定能有效抵抗黑化真菌感染¹⁰⁵。Esterre 等发现，CBM 患者在真菌治疗后抗体滴度下降¹¹⁰。观察发现，在重度 CBM 中免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）生成增多。生活在流行地区的个体若此前暴露于该类真菌，则可能产生特异性体液免疫应答，但这与 CBM 的严重程度并无明确相关性¹¹¹。有些抗体可以抵御 CBM。抗裴氏丰萨卡菌黑色素抗体可增强吞噬细胞抑制真菌生长的效果¹¹²。有些患者在疾病进展期或治疗开始后出现局部色素脱失，这表明抗黑色素抗体与人黑色素细胞发生交叉反应，这种现象被称为白癜风（图 2）。

(1) 抗葡糖神经酰胺（抗 GlcCer）单抗在裴氏丰萨卡菌分生孢子上偶联可减轻真菌负荷，增强鼠细胞对裴氏丰萨卡菌的吞噬和破坏。在其他因素中，免疫球蛋白水平可能干扰宿主对黑化真菌的应答¹⁰⁵（表 3）。