药物可穿透进入细胞,与染色体结合。实验显示多柔比星的平面环插入碱基对之间从而与 DNA 结合形成复合物,严重干扰 DNA 合成、DNA 依赖性 RNA 合成和蛋白质合成。但通过该机制产生抗增生作用所需的多柔比星浓度要多于临床治疗中肿瘤部位所能达到的药物浓度要高。近期的实验显示药物插入 DNA 引发拓扑异构酶 II 裂解 DNA,从而破坏 DNA 的第三级结构。这一作用在临床治疗的药物浓度下即可见。多柔比星还与氧化/还原作用有关:一系列 NADPH 依赖性的细胞还原酶可将多柔比星为半醌自由基,再与分子氧反应产生高反应活性的细胞毒化合物如过氧化物、活性的氢氧基和过氧化氢,自由基形成与多柔比星的心脏毒性作用有关。多柔比星的更进一步作用部位可能在细胞膜:与细胞膜上的脂结合影响各种不同的功能。多柔比星的细胞毒作用和/或抗增生作用可以是上述任何一种机制的结果,也可能还有其他作用机制存在。